可能需要对组织进行显微镜检查以区分侵袭性疾病和表面感染——这通过培养方法不易实现。
尽管未染色的湿片样品可用于检测真菌和某些其他病原体，但大多数样品都用染色剂处理，使病原体颜色鲜艳，使它们从背景中显示出来。
临床医生根据可能的病原体进行染色。然而，没有一种染色剂是100%特异的（即不同的生物体可能有类似的染色）。大多数样本用革兰染色处理，如果怀疑是分枝杆菌，则用抗酸染色处理。然而有一些病原体使用这些染剂则不能被轻易观察到；如果怀疑是此类病原体，需要使用不同的染剂或采用其他可以进行鉴定的方法。
因为显微镜下检测通常要求微生物浓度至少达到约1×104-5/mL，所以大多数体液标本（如脑脊液）在检查前都需要浓缩处理（如通过离心）。
光学显微镜可以快速完成，但准确性取决于显微镜医生的经验和设备的质量。法规通常限制医生在非认证实验室之外将显微镜检查用于诊断。
革兰氏染色法
革兰染色具有以下作用：
革兰染色是通过细菌能保留紫色晶体染剂（革兰阳性——蓝色）或不能保留（革兰阴性——红色）来将细菌分类。
突出显示细胞形态（例如杆菌、球菌）和细胞排列（例如聚集成团、成链、成对）。
鉴定多形核白细胞，表明细菌感染而非定植
这些特征可在最终鉴定结果出来之前指导抗生素治疗。 革兰染色后发现具有多种形态及染色特征的微生物混合物，提示样本受到污染或多种微生物细菌感染。在痰标本中发现许多鳞状细胞，表明标本被唾液污染，因此诊断作用有限。
革兰染色是将标本通过热固定于载玻片上，相继用革兰紫色晶体、碘、脱色剂和复染剂（具有代表性的是番红精）处理。
这张图像是革兰氏染色的 大肠杆菌 光学显微镜照片，该菌为杆状、有活动能力的细菌。红色表明它们是革兰氏阴性菌。放大倍数为400倍，尺寸为35毫米。
这张图像是革兰氏染色的 肺炎链球菌 （又称 肺炎球菌）的光学显微镜照片，其为圆形细菌（球菌），通常成对出现，有时呈短链状。蓝色表明它们是革兰氏阳性菌。印刷 10 厘米宽时，放大倍数为 1450 倍。
抗酸染色和改良抗酸染色
这些染色方法用于检测以下病原：
抗酸染色阳性的病原（Mycobacterium 属）
抗酸染色弱阳性的微生物（主要是诺卡氏菌属）
Rhodococcus（红球菌属）及相关属
分枝杆菌在痰液中的含量达到10,000个/mL就能被检测出，但是因为它常常在标本中以更低的浓度水平存在，检测的灵敏度因此受限。 通常，数mL的痰液用氢氧化钠去污染后经过离心浓缩，才进行抗酸染色。尽管一些中等抗酸的微生物很难从分枝杆菌中区分出来，但是这种方法的特异度仍较可信。
这张图像是含有结核分枝杆菌的抗酸染色痰液样本的光镜照片。经过酸性酒精处理后仍然呈红色表明它们是抗酸的。
这张图片是瘤型麻风病人皮肤活检组织中经改良的齐尔-尼尔森染色（韦德-菲特染色）显示的麻风分枝杆菌的光学显微镜照片。分枝杆菌呈红色，大量存在，既有单独存在，也有集群存在（globi）。在 10 厘米宽打印时，放大倍数为 20 倍。
荧光染色
荧光染色可用于检测更低浓度的标本（<1×104细胞数/mL）。例如：
吖啶橙（细菌和真菌）
金胺-罗丹明和金胺O染色（分枝杆菌）
钙氟白（真菌，尤其是皮肤真菌）
将荧光染料偶联至针对病原体的抗体（直接或间接免疫荧光）理论上可以提高检测的灵敏度和特异度。 然而由于这些试验结果的解读和解释有一定的困难，因此商业上仅极少数方法有利用价值而常规使用（如Pneumocystis and Legionella直接荧光抗体试验）。
这张图片显示的是对癌症患者支气管肺泡灌洗液样本中的 耶氏肺孢子虫 进行的直接免疫荧光抗体染色。
湿片法
湿载的未染色样品可用于在暗场显微镜下检测以下物质：
为了提高真菌的可分辨度，可用10%氢氧化钾（KOH）溶解周围的组织和非真菌病原体。
盐水湿涂片检查显示，大的有核阴道鳞状上皮细胞，几乎看不见的小细菌和中等大小的白细胞。放大倍数为400倍。
墨汁染色法
印度墨汁（胶体碳）染色主要用于检测细胞悬浮液（如脑脊液沉淀物）中新型隐球菌和其他具有包囊的真菌。该方法主要是使背景视野被染色而不是微生物本身被染色，染色后使微生物的荚膜呈晕轮状而易被观察到。在CSF中其灵敏度不如隐球菌抗原检测。特异度也受到限制：白细胞也可能呈现包囊状。
此图像是印度墨汁染色的新型隐球菌的光学显微镜照片。印度墨汁染色使生物体周围的囊状物可见光环（发光的环）。
Warthin-Starry染色法和Dieterle染色法
这些银染色用于观察细菌，例如：
此图像显示了Warthin-Starry银染汉氏巴尔通体细菌的光显微镜照片。在Warthin Starry染色的情况下，它们看起来像是黑色弯曲的小生物，无论是单个还是集群，就像显微照片的中心一样。它们通常出现在坏死区域和血管中。
此图像是心脏组织样本中Warthin-Starry染色的伯氏疏螺旋体细菌（箭头所示）的光学显微镜照片。
赖特染色和吉姆萨染色
这些染色方法用于检测以下微生物：
Wright Giemsa染色剂是染色为蓝色的碱性染料（亚甲基蓝）和染色为红色的酸性染料（曙红）的混合物。 因此，细胞的酸性成分（细胞核，细胞质RNA，嗜碱性颗粒）染成蓝色或紫色，而细胞的碱性成分（Hb，嗜酸性颗粒）染成红色或橙色。
三色染色法（Gomori-Wheatley染色法）和铁苏木精染色法
这些染色方法用于检测肠道内的原虫。
果莫里-Wheatley染色用于检测微孢子虫。它可能遗漏蠕虫卵和幼虫，并且不能可靠地识别Cryptosporidium（隐孢子虫属）。真菌和人的细胞会被染色。
铁苏木精染色可以对细胞、细胞包含物和细胞核进行鉴别染色。蠕虫卵可能染色过深而无法识别。
此图像显示了三色染色囊胚腔原虫。
