药敏试验通过将标准浓度的微生物暴露于特定浓度的抗菌药物中，来确定微生物对抗菌药物的敏感性。药敏试验可用于细菌、真菌和病毒。对于某些病原体，使用一种抗菌药物的药敏结果可预测同类药物的敏感性。因此并非所有潜在有效的抗菌药物均需经过测试。
药敏试验在体外进行，因此在体内可能影响治疗成功与否的诸多因素（如药效学和药代动力学、特定部位的药物浓度、宿主的免疫状态、特定部位宿主的自我防御机制）未被考虑在内。因此，药敏试验的结果不是总能预测治疗效果。
药敏试验可通过定性法、半定量法或基于核酸的方法进行。试验也能测定不同的抗微生物制剂组合后的疗效（增效试验）。
定性法
定性法的准确性较半定量法差。结果通常报告为以下之一：
敏感
中介
耐药
一些尚未建立耐药标准的菌株可能仅被报告为敏感或不敏感。表示S、I和R的特定药物浓度的确立基于多种因素，特别是药代动力学、药效学、临床和微生物学数据。
对于生长速度快的微生物，通常适合使用圆盘扩散法（也被称为Kirby-Bauer试验）进行试验。该方法是将浸透有抗生素的圆盘放置于已经接种了待检测微生物的琼脂平板上。孵育后（通常为16～18小时），测量每一个圆盘周围的抑菌环直径大小。根据每一微生物-抗生素组合所显示的直径大小而分别表示为S、I或R。
半定量法
半定量方法用于测定在体外抑制特定微生物生长的最低抗菌药物浓度。该最小抑菌浓度（MIC）以数值表示，可归类为以下4组之1：S（敏感）、I（中介）、R（耐药）或有时为不敏感。MIC的测定主要用于细菌分离株，包括分枝杆菌和厌氧菌，有时也用于真菌，特别是 Candida（念珠菌）属。
也可以测定最小杀菌浓度（MBC），但是在技术上有一定困难，解释结果的标准也尚待确定。MBC测试的价值在于它能提示一种抗菌剂是抑菌剂或是杀菌剂。
抗菌剂可在琼脂或肉汤中稀释，然后接种微生物。肉汤培养基稀释法是金标准，但是该方法工作量大，因为在每一根试管中只能检测一种药物的浓度。一种更有效的方法是使用一种聚酯薄膜制成的条带，在条带上沿长轴方向依浓度梯度浸透有抗菌剂。将条带放置于含有接种物的琼脂平皿上，根据开始出现对微生物产生抑制的条带位置可确定最低抑菌浓度（MIC）；在同一平皿上可以对多种抗菌剂进行检测。
MIC与微生物对药物的敏感性以及游离药物（未与蛋白结合的药物）在组织中达到的浓度相关。如果药物在组织中的浓度高于MIC，可以达到理想的治疗效果。从MIC研究得到的S、I和R结果通常与可达到的血清、血浆或尿液中游离药物浓度相关。
以核酸为基础的检测法
这些试验运用了类似于应用于微生物鉴定的核酸技术，但是这些技术在经过改良后主要用于测定耐药基因或者突变。以mecA为例，这是S. aureus（金黄色葡萄球菌）对苯唑西林产生耐药性的基因；若存在该基因，则无论药敏结果如何，均认为微生物对大多数beta（β）-内酰胺类药物耐药。然而，虽然已经发现了一定数量的类似基因，但是它们的出现并非都导致耐药的发生。并且，由于可能有新的突变或者其他耐药基因出现，因此它们的缺失不能保证药物的敏感性。由于这些原因，常规的表型药敏试验方法仍然是评估细菌和真菌对抗微生物药物敏感性的标准方法。
然而，基于核酸的方法是以下情况的首选方法：
快速诊断高危人群中的耐多药结核
从阳性血培养物中直接获得的微生物，快速检测其可能的耐药性
