以核酸为基础的方法是测定从微生物中提取的微生物特异性DNA或RNA序列。序列在体外可以或者不可以被扩增。
基于核酸（分子）的鉴定方法在临床应用已越来越普遍;由此产生的快速鉴定结果可使患者能够接受特定的抗菌治疗，从而避免因经验性治疗或潜在的不合理用药导致疗程延长。
以核酸为基础的方法通常具有高特异度、高灵敏度，可用于检测所有种类的微生物，并可快速提供结果。结果能够快速得到。因为每个检测通常是针对特定的微生物，临床医师必须知道可能的诊断以此来进行相应的监测。 例如，当一个有流感症状的病人来就诊，而当时流感季节已经结束了，那么去做更普遍的病毒诊断性试验（例如病毒培养）远好于去做流感相关的特异性检测，因为其他的一些病毒（如副流感病毒、腺病毒）可能就是病因。
最近的进展已经使得多重分析得到了发展，其中一个基于核酸的试验可以检测并区分≥2个的致病微生物。多重检测目前可用于检测生物战剂、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型变种和某些呼吸道病原体（即，多重检测包括一组呼吸道病毒，如呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感、副流感，以及非病毒病原体，如肺炎球菌、支原体和衣原体）。多重测定与单靶测定具有相似的灵敏度和特异性，但大多是定性的，在给定的患者中可能更难解释。
基于核酸的检测是定性的，但针对有限却数量不断增加的感染（如乙肝病毒、丙肝病毒、HIV、巨细胞病毒、人T淋巴细胞病毒）可以采用定量方法；这些方法可用于诊断和监测对治疗的反应。
未扩增核酸检测技术
核酸扩增
核酸扩增技术是将少量微生物DNA或RNA复制许多倍，这样就可以对样本中非常微量的微生物进行检测，并且不需要进行培养。 这些技术尤其适用于通过培养或者用其他方法检测有困难的病原（如病毒、专性细胞内病原体、真菌、分枝杆菌等），或者那些微量存在的微生物。
这些检验可能涉及
靶片段扩增（如PCR[聚合酶链反应]、逆转录酶-PCR [RT-PCR]、链移位扩增、转录扩增）
信号放大（如分支DNA测定、杂交捕获）
探针扩增（如连接酶链式反应、切割酶侵入、循环探针）
扩增后分析（如扩增产物测序、微阵列分析和实时PCR过程中的熔解曲线分析）
在送至分子诊断实验室之前，合理的标本采集及保存是非常重要的。由于扩增技术非常灵敏，来自样本或者设备的微量污染都可导致假阳性结果。
尽管具有很高的灵敏度，但是有时即使患者已出现临床症状时仍有假阴性结果（如西尼罗河病毒感染）。 假阴性结果可以通过以下方法最小化：
避免使用木制柄的或者头端为棉的拭子（拭子应能用于扩增检测）
迅速将标本转运
转运时间>2小时的标本应冷藏或冷冻
在核算扩增检测中冰冻是最典型的标本保存方法。 然而如果怀疑的病毒本身不稳定（如水痘-带状疱疹病毒，流感病毒，HIV-2）或者需要进一步做病毒培养（标本冷冻后可能无法用于标准培养），那么标本应该冷藏保存而不是冷冻。
